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STED: Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie
Funktionsprinzip
In der STED-Mikroskopie kommt ein zweiter, ringförmiger Laserstrahl zum Einsatz, der die Fluoreszenzmoelküle in der Peripherie des Anregungsvolumens ausschaltet.
Farbkodierte Abbildungen der Intensität des Anregungslaserstrahls (oben links, grün) und des ringförmigen Abregungslaserstrahls (oben rechts, rot). Untere Reihe: Zeughörige Intensitätsprofile durch die Zentren der Strahlintensitäten, wie durch die Dreiecke angedeutet.
Beide physiko-chemischen Prozesse, die Anregung sowie die stimulierte Emission, die zur Abregung dient, hängen von der Intensität der entsprechenden Laserstrahlen ab. Die exakte physikochemische Beschreibung liegt außerhalb des Fokus dieser Webseite. Für ein grundlegendes Verständnis ist es ausreichend sich vor Augen zu führen, dass beide Prozesse einer gewissen, intensitätsabhängigen Wahrscheinlichkeit unterliegen. Da Wahrscheinlichkeiten nur zwischen $0$ und $1$ liegen können, kann folgende Funktion genutzt werden, um sie zu beschreiben:
$$ p(I) = 1-\exp(-I/I_0) $$
Zusammenhang zwischen Intensität und der Wahrscheinlichkeit, einen Änderung im Energiezustand eines Moleküls herbeizuführen.
Hier bezeichnet $i$ die Intensität und $I_0$ eine Konstante, die die Steilheit der Kurve angibt. Die Wahrscheinlichkeit an der Stelle $I=I_0$ beträgt 67%. Ein genereller Verlauf des obigen Zusammenhangs ist in der Abbildung links dargestellt. Zu beachten ist, dass eine die Änderung der Wahrscheinlichkeit im Bereich niedriger Intensität groß ist, für hohe Intensitäten hingegen ist die Wahrscheinlichkeit nahezu konstant und nahe eins. Auch wenn die Wahrscheinlichkeit nie wirklich eins wird, kann man hier $p≈1$ annähern
Aus der obigen Beziehung sowie dem Intensitätsprofil des Abregungslasers kann man die Wahrscheinlichkeit für einen bestimmten Ort bestimmen:
$$ p(x) = 1-\exp(-{I(x)}/I_0))\text{.} $$
Ortsabhängige Wahrscheinlichkeit $p(x)$ (durchgezogene blaue Linie, rechte Achse) sowie Intensitätsprofil des Abregungslasers (gepunktete rote Linie, linke Achse). Eine Wahrscheinlichkeit von 67% und die zugehörige Intensität $I_0$ sind als gepunktete graue Linien eingezeichnet.
Hier bezeichnet $I(x)$ die Intensität des laserstrahl am Ort $x$, wie in dem Intensitätsabbildungen der Laserstahlen oben auf der Seite. Der Abregungs-laserstahl induziert Emission mit einer Wahscheinlichkeit, wie in der Abbildung rechts gezeigt. Ist die Intensität des abregenden Laserstahls weit höher als $I_0$, wird der Übergang vom maximum zum zentralen Minimum der Wahrschinelichkeit deutlich steiler als im Intensitätsprofile
Die so induzierte emission wird in der STED Mikroskopie ausgefiltert, so dass sich Moleküle, die stimuliert abgeregt wurden, in einem Aus-Zustand befinden. Nur Moleküle, die angeregt sind und spontan emittieren tragen zum Signal bei und befinden sich somit in einem An-Zustand.
Zusammenfassend lassen sich die Vorgänge wie folgt beschreiben: Durch den Anregungslaser werden die Moleküle, abhängig von der Intensität, in den An-Zustand gebracht (die Wahrscheinlichkeiten dafür werden hier der Einfachheit halber vernachlässigt), durch den Abregungslaser werden einige Moleküle wieder in den Aus-Zustand versetzt. Dadurch verkleinert sich die Breite des Bereichs, aus dem spontane Fluoreszenz herrührt, wir in der Abbildung links zu sehen ist.
Ursprung der Fluoreszenz $f(x)$ mit (durchgezogene Linie) und ohne (gestrichelte Linie) Abregungslaser. Durch den Abregunsglaser wird der Bereich, aus dem spontane Emission herrühren kann, verringert.
Für höhere Intensitäten des Abregungs-Laserstrahls wird die Breite der Fluoreszenz-Ursprungs immer kleiner. Die Auflösung $Δd$ skaliert daher mit der Intensität in folgendem Zusammenhang:
$$ \Delta d=\Delta d_0 \sqrt{I/{I_S}} ^{-1}\text{,} $$wobei $I_S = {\ln 2}{I_0}^{-1}$ die Intensität bezeichnet, bei der 50% der Moleküle im angeregten Zustand sind und $\Delta d_0$ bezeichnet die Auflösung ohne Einsatz des Abregungsstrahls. Die intensitätsabhängige verbesserung der Auflösung ermöglicht es, Aufnahmen mit höherem Detail-Level aufzunehmen, wie im folgenden Bild anhand eines Vergleichs einer konfokalen und einer STED-mikroskopischen Aufnahme von fluoreszierenden Nanopartikeln verdeutlicht wird.
Konfokale (links) und STED-mikroskopische (rechts) Aufnahme des selben Bereichs derselben Probe fluoreszierender Nanopartikel. In der Mitte sind die markierten Bereiche vergrößert dargestellt.
